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정보가 많이 없어 도움을 드리기가 힘들지만 error가 크다는 것은 기기적인 결함이 아닌 경우 딱히 문제될 것이 없습니다.
현재 말씀주신 정보를 바탕으로 모든 것이 이상없다고 생각할 때 해볼 수 있는 것은..
원하는 타겟의 Cq 값이 너무 낮은 상태에서 error가 큰 것이 아니라면..cDNA를 10배 희석 시킨 뒤 한 번 test 해보는 것이 좋을 것 같습니다.
1) Isolation RNA
저의 strain은 bacteria입니다. 실험실에 있는 kit를 사용하여 RNA를 isolation하였습니다. nanodrop으로 RNA 농도를 측정하였습니다. 측정결과 320-150ng/micro liter, 260/280 2.1 , 260/230 1.89-0.66 (대략적으로) 나왔습니다.
Q) nanodrop protocol을 보니 260/230 값이 260/280보다 낮은 경우 contamination일 수 있다고 하는데요. 제가 isolation한 RNA를 사용하여 계속 실험을 하기에는 문제가 있는 건가요?
->큰 문제는 없어보입니다.
2) cDNA
protocol에 따라서 500ng RNA를 cDNA로 바꾸었습니다. 총량 10micro liter.
37도 15분
85도 30초
16도
-> 될 수 있으면 1ug을 만들어서 해보시는 것을 추천드립니다. RT 프로토콜에서 DW를 전부 RNA로 해도 문제는 별로 없습니다. 다만 프라이머 붙이는 것은 잊지 말아주시구요.
3) SYBR Green Master mix를 이용하여 real time PCR을 하였습니다.
cDNA 2 micro liter -> (1ug으로 만들었다면 1ul로)
Forward primer 0.8 -> 1
Reverse primer 0.8 -> 1
2X SYBR Green master mix 10
ddH2O up to 20
로 준비 후, 3 step amplication으로 45cycl 돌렸습니다.
하지만, error bar가 너무 큽니다. Cq error (정상인 경우: <0.5) 값이 가장 큰 경우는 10 입니다.
이렇게 error가 너무 큰 경우 어디서 잘못된 것일까요?
졸업날짜는 다가오는데... 계속 결과가 error bar가 너무 커서... 사용할 수 없어서 너무 속상합니다.
같은 경험을 가지고 계셨던 분들, 혹은 real time PCR의 대가님들 많이 도와주십시오~
전체적으로 프로토콜에는 딱히 문제는 없어보입니다. 저희 연구실에서 쓰는 프로토콜이랑 조금 달라서 코멘트를 썼을 뿐 큰 의미는 없습니다. 개인적인 경험을 통해 말씀드리겠습니다.
1. 파이펫팅의 스킬에 따른 오류. 어떤 플레이트를 쓰는지는 모르겠습니다만 384웰을 쓴다면 파이펫팅의 스킬에 따라 왔다갔다 할 수 있습니다. 또는 파이펫의 노후화에 따른 스프링 문제일 수도 있구요. 될 수 있으면 파이펫은 최대 10 ul짜리를 써서 정확도를 높이는 것도 추천드립니다. 물론 전용 팁이 있구요.
2. 플레이트에 마킹. 플레이트를 마킹(레이블링, 이름 쓰는것)한답시고 멋지게 끄적끄적 하는 경우 측정시 방해할 확률이 매우 높습니다. 더군다나 몇방울이 웰 안으로 튄다면 그것 확 튀어버립니다. 레이블링은 최대한 플레이트에 자신만 알아보게 최소한의 마킹만 하세요. 그리고 니트릴/라텍스 글러브를 끼고 작업하시길 바랍니다.
3. 웰 벽에 뭍어 나오는 샘플들. 이것은 파이페팅 스킬에도 적용됩니다. 384웰의 경우 매우 좁기때문에 웰벽에 샘플을 대고 넣으면 거품이 입구까지 생깁니다. 그러면 작업하면서 손에 묻으면서 다른 웰에 컨탐을 시키게 되죠. 게다가 팁의 바깥쪽 벽에 미묘하게 묻은 버퍼가 샘플을 넣는 과정에서 벽에 묻어나오는 경우 입구 근처에 묻기 때문에 손에 묻어서 컴탐이 되거나 볼룸이 틀어지면서 농도가 달라질 수도 있죠.
딱히 보이는 것에 한해서는 (적어주신 프로토콜) 문제는 없어보이니 '손기술'에서 컨탐이 생기는 것으로 보입니다.